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Eines der bekanntesten und auch reizvollsten Beispiele, das die Detektion einzelner Moleküle notwendig macht, ist die Sequenzierung eines einzelnen DNA-Stranges. Im Gegensatz zu bisher üblichen DNA Sequenziermethoden, die auf Sangers enzymatischer Kettenabbruchmethode beruhen, würde eine auf Einzelmolekülfluoreszenz basierende DNA-Sequenzierung es ermöglichen, die Sequenz eines einzelnen DNA-Fragmentes von mehreren zehntausend Basen Länge mit einer theoretischen Rate von mehreren hundert Basen pro Sekunde zu lesen. Das Konzept basiert darauf, dem schrittweisen Einbau von DNA-Basen durch Polymerase-Enzyme in einen einzelnen DNA-Strang „zuzuschauen“. Wenn jede Base identifiziert werden kann, während sie in den DNA-Strang eingebaut wird, kann man direkt die Sequenz erhalten. Dazu analog könnte man auch den umgekehrten Prozess beobachten, d. h. es wäre möglich, einen einzelnen DNA-Strang mittels einer Exonuklease Base für Base von einem Ende aus zu degradieren und jede Base nach der Abspaltung zu identifizieren. Mehrere DNA Stränge können nicht gleichzeitig benutzt werden, da Unterschiede in der Einbau-, bzw. Schneideraten an verschiedenen DNA-Strängen eine zeitliche Synchronisation verhindern. Diese elegante Alternative zu üblichen Sequenziertechniken benötigt die minimal denkbare Menge an Ausgangsmaterial, um eine Sequenz zu erhalten. Obwohl es einfach klingen mag, stellt die Realisierung der Einzelmolekülsequenzierung eine der größten Herausforderungen dar, der sich Biologen, Chemiker und Physiker gestellt haben.



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Aus biologischer Sicht stellt die Verwendung fluoreszenzmarkierter Nukleotide ein großes Problem dar. Die sperrigen Fluoreszenzfarbstoffe an den Nukleotiden könnten den von der Polymerase bzw. Exonuklease gesteuerten Einbau bzw. Abbau von Nukleotiden behindern. Außerdem sind die wohldefinierte Auswahl eines einzelnen DNA-Stranges und die Detektion und sichere Identifizierung jedes einzelnen Nukleotids aufgrund der spektroskopischen Eigenschaften seines Fluoreszenzlabels sehr schwierig. Auch wenn das Hauptziel der Sequenzierung eines einzelnen DNA-Stranges noch nicht erreicht worden ist, ist jeder einzelne Schritt wichtig für die Entwicklung und Verbesserung von analytischen Forschungsansätzen, die in der Lage sind, biochemische Prozesse (z.B. Enzymaktivitäten) auf Einzelmolekülebene zu verfolgen.



pictureVerantwortlich für den Inhalt dieser Seite: Prof. Dr. Markus Sauer