ATPase

Die V-ATPase ist die dominante primäre Protonenpumpe der Vakuole und der sekretorischen Endomembranen eukaryotischer Zellen. Sie säuert unter ATP-Hydrolyse im Cytosol das Lumen von Endomembranvesikeln und die Vakuole an und erzeugt ein Membranpotential. Die dadurch entstehenden elektrochemischen Triebkräfte werden für Transportprozesse wie die Akkumulation von u.a. Na⁺, Cd²⁺, Zn²⁺ und Glucosiden verwendet. Dadurch ist die V-ATPase zentral wichtig für die Entwicklung und Anpassung Höherer Pflanzen. Neben diesen fundamentalen Funktionen im Stoffwechsel ist die V-ATPase aus zwei Gründen Modell für molekulare Prozesse in der Zelle: Die V-ATPase ist ein molekularer Motor, in dem ein Rotor aus den Untereinheiten VHA-c, VHA-c’’, VHA-D und VHA-F in einer Statorstruktur aus den übrigen Untereinheiten rotiert (VHA-A, -B, -C, -E, -G, -H, -a, -d). Dadurch wird die Hydrolyse von ATP im Kopf des Stators an die H⁺-Bewegung im Rotor gekoppelt. Die Komplexität des Aufbaus aus 13 verschiedenen Untereinheiten (vermutete Stöchiometrie der Zusammensetzung: A₃B₃CDE₂FG₂Hac₅c’’d) verlangt Koordination der Expression, sowie Mechanismen der Assemblierung und Regulation. Diese Fragestellungen werden in einem interdisziplinären Projekt des Sonderforschungsbereichs 613 bearbeitet.
Teilprojektleiter sind Karl-Josef Dietz und Dortje Golldack (Biochemie und Physiologie der Pflanzen) und Markus Sauer (Laserphysik). Durch die Kombination physikalischer, molekularbiologischer und biochemischer Ansätze soll die Struktur und konformations-abhängige Funktion des multi-heteromeren Proteinkomplexes der vakuolären ATPase (V-ATPase) der Pflanzen beispielhaft für die Verwendung dieser Methoden an anderen Proteinkomplexen aufgeklärt werden. Das Projekt gliedert sich in zwei Vorhaben: Ausgewählte Untereinheiten werden als Fusionsproteine mit dem "Green Fluorescent Protein" oder dessen chromophoren Mutanten (z.B. YFP) exprimiert. Mit Hilfe der Einzelmolekülspektroskopie, des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET), der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) und zeitaufgelöster Spektroskopie werden Protein-Protein-Interaktionen zunehmender Komplexität in vitro, nach Synthese im zellfreien Extrakt, und in lebenden Zellen untersucht. Das Vorkommen und die Struktur der V-ATPase wird mittels AFM an isolierten Endomembranen und am nativ gereinigten und solubilisierten V-ATPase-Komplex untersucht, wobei der Einsatz spezifischer Antiseren die Lokalisierung von bisher nicht zugeordneter Untereinheiten im Gesamtkomplex ermöglichen soll.

Dietz K-J, Tavakoli N, Kluge C, Mimura T, Sharma SS, Harris GC, Chardonnens AN, Golldack D (2001) Significance of the V-type ATPase for the adaptation to stressful growth conditions and its regulation on the molecular and biochemical level. J. Exp. Bot. 52, 1969-1980

Kluge C, Lamkemeyer P, Tavakoli N, Golldack D, Kandlbinder A, Dietz KJ (2003) cDNA cloning of a set of all 12 subunits of the V-type ATPase from Mesembryanthemum crystallinum and their expression under stress. Molecular Membrane Biology 20, 171-183

Kluge C, Lahr L, Hanitzsch L, Bolte S, Golldack D, Dietz K-J (2003) New insight into the structure and regulation of the plant vacuolar V-ATPase. J. Bioenerg. Biomemb. 35, 377-388

Kluge C, Seidel T, Bolte S, Sharma SS, hanitzsch M, Satiat-Jeunemaitre B, Roß J, Sauer M, Golldack D, Dietz K-J (2004) Subcellular distribution of the V-ATPase complex in plant cells, and in vivo localisation of the 100 kDa subunit VHA-a within the complex. BMC Cell Biol. 5, 29

Seidel T, Kluge C, Hanitzsch M, Ross J, Sauer M, Dietz K-J, Golldack D (2004) Colocalization and FRET-analysis of subunits c and a of the vacuolar H+-ATPase in living plant cells. J. Biotechnology 112, 165 - 175

Seidel T, Golldack D, Dietz K-J (2005) Mapping of C-termini of V-ATPase subunits by in vivo-FRET measurements. FEBS Lett. 579, 4374 - 4382