Sonderforschungsbereich 521 / B4


 

 

Sonderforschungsbereich 521 / B4 - Modellhafte Leistungen Niederer Eukaryonten

 

Projekt B 4: Vom Einzeller zum Vielzeller - Molekulare Entwicklung in niederen Grünalgen (Volvocales)


Zusammenfassung

Das vorliegende Projekt soll dazu beitragen die stammesgeschichtliche Entwicklung vom Einzeller zum Vielzeller zu verstehen. Welche molekularen Veränderungen waren erforderlich um diese Entwicklung realisieren zu können? Die niederen Grünalgen der Ordnung Volvocales eröffnen die einzigartige Gelegenheit, diesen Übergang vom Einzeller zum Vielzeller exemplarisch innerhalb einer eng verwandten Gruppe rezenter Arten zu untersuchen. Die Komplexität der Morphologie nimmt in dieser Ordnung vom Einzeller über verschiedene Zwischenstufen bis hin zum echten Vielzeller ständig zu.
Auf dem Weg zu Vielzelligkeit war die Entwicklung einer komplexen extrazellulären Matrix (ECM) mit vielfältigen Funktionen eine wichtige Notwendigkeit. Im Antragszeitraum sollen deshalb neue ECM/Zellwand-Komponenten aus unterschiedlich hoch entwickelten Mitgliedern der Volvocales identifiziert und deren Strukturen und Eigenschaften untersucht und verglichen werden. Auch sollen bereits bekannte ECM/Zellwand-Proteine weiter charakterisiert werden. Ziel ist es letztendlich, diejenigen Moleküle oder Moleküleigenschaften zu identifizieren, die essentiell sind um eine komplexe ECM zu bilden und somit auch die Entwicklung zur Vielzelligkeit zu ermöglichen.


Stand der Forschung

In der Ordnung der Volvocales kann der Übergang vom Einzeller zum Vielzeller exemplarisch innerhalb einer eng verwandten Gruppe untersucht werden. Die Komplexität der Morphologie innerhalb der Volvocales nimmt vom Einzeller Chlamydomonas über die Mehrzeller Gonium, Pandorina, Eudorina und Pleodorina bis hin zum echten Vielzeller Volvox (mit Trennung in somatische und reproduktive Zellen) ständig zu. Dieser Übergang von der Einzelligkeit zur Vielzelligkeit fand in den Volvocales vor ~200 Millionen Jahre statt und stellt damit ein recht junges Ereignis in der Evolution dar. Eine der wichtigsten Grundvoraussetzungen um diesen Übergang zur Vielzelligkeit realisieren zu können war die Entwicklung einer komplexen extrazellulären Matrix (ECM) mit vielfältigen Funktionen, ausgehend von einer einfachen Zellwand. Es stellt sich die Frage, welche Veränderungen auf molekularer Ebene nötig waren um eine derartige Entwicklung zu ermöglichen.
Die ECM von Volvox carteri wurde in den vergangenen Jahren bereits morphologisch und biochemisch untersucht. Die ECM von Volvox besteht aus einer großen Zahl anatomisch verschiedener Strukturen mit einer definierten Raumverteilung im Sphäroiden. Mittels licht- und elektronenmikroskopischer Untersuchungen haben David Kirk und Mitarbeiter (Kirk et al., 1986) die ECM-Architektur analysiert und eine Nomenklatur der komplexen ECM-Strukturen erarbeitet.
In den vergangenen Jahren konnten auch über zehn ECM-Proteine von Volvox kloniert und charakterisiert werden (zusammengefasst in Sumper und Hallmann, 1998). Dabei zeigte sich, dass der Aufbau der ECM-Proteine aus Volvox meist modular ist, wobei Hydroxyprolin-reiche Abschnitte mit Hydroxyprolin-freien Modulen alternieren. Die ECM-Proteine von Volvox sind also ebenso modular aufgebaut wie die Proteine tierischer ECMs, wobei allerdings die Domänen anders strukturiert sind.
Die ECM-Biosynthese beginnt in Volvox am Ende der Embryogenese unmittelbar nach einem morphogenetischen Prozess bei dem sich der Embryo komplett umstülpt, ein Vorgang den man Inversion nennt. Mit biochemischen und immunoelektronen-mikroskopischen Untersuchungen konnte ein ECM-Glykoprotein, genannt ISG, identifiziert werden, das nur während der Inversion synthetisiert wird und das den Grundstein bei der ECM-Biosynthese legt.
Die ECM von Volvox ist kein starres Gebilde, sondern wird ständig durch äußere Einflüsse oder entwicklungsabhängig modifiziert. Eine ganze Reihe von ECM-Glykoproteinen konnte identifiziert werden, die bei Anwesenheit des Sexualpheromons synthetisiert werden; ein Pheromon, das letztendlich eigentlich dafür verantwortlich ist, dass vegetativ wachsende reproduktive Zellen für die sexuelle Entwicklung umprogrammiert werden. Erstaunlich ist, dass ein Großteil dieser Pheromon-induzierten Proteine auch eine Sequenzhomologie zum Sexualpheromon besitzen.
Neben diesen ECM-(Struktur)Proteinen konnten auch mehrere induzierbare ECM-Enzyme in Volvox gefunden werden, wie sie beispielsweise für den ECM-Umbau benötigt werden.
Auch an der Zellwand von Chlamydomonas wurden bereits vor einigen Jahren vor allem durch die Arbeitsgruppe um Ursula Goodenough und John Heuser elektronenmikroskopische und biochemische Untersuchungen durchgeführt. Dabei wurde eine Zellwand-Nomenklatur etabliert und es konnten Informationen zur Assemblierung der Zellwand gewonnen werden. Von einigen Zellwandproteinen aus Chlamydomonas ist auch die Primärstruktur bekannt; auch sie sind zum Teil modular aufgebaut. Erste Vergleiche lassen vermuten, dass im Laufe der Evolution einzelne Module der Zellwand/ECM-Glykoproteine durch andere Module ausgetauscht wurden. Für detailliertere Aussagen sind weitere Daten erforderlich. Bislang sind noch keine ECM-Glykoproteine aus Gonium, Pandorina, Eudorina oder Pleodorina bekannt.

 

Literatur:

Kirk, D. L. (1998) Volvox: Molecular-genetic Origins of Multicellularity and Cellular Differentiation, Developmental and Cell Biology Series. Cambridge: Cambridge University Press.

Kirk, D. L., Birchem, R. and King, N. (1986) The extracellular matrix of Volvox: a comparative study and proposed system of nomenclature. J. Cell Sci., 80, 207-231.

Goodenough, U. W., Gebhart, B., Mecham, R. P. and Heuser, J. E. (1986) Crystals of the Chlamydomonas reinhardtii cell wall: polymerization, depolymerization, and purification of glycoprotein monomers. J. Cell Biol., 103, 405-417.

Sumper, M. and Hallmann, A. (1998) Biochemistry of the extracellular matrix of Volvox. Int. Rev. Cytol., 180, 51-85.

 

Eigene Vorarbeiten

Ausbau der genetischen Manipulierbarkeit

Dominante Selektionsmarker werden bei einer Vielzahl molekulargenetischer Ansätze benötigt. Das bakterielle ble-Gen, das Resistenz gegen Zeocin vermittelt, konnte in Volvox nach sehr starken Modifikationen des Gens (u.a. Einsetzen von zwei Volvox-Arylsulfatase-Introns) und nach Erhöhung der Gendosis mittels der in diesem Zusammenhang entwickelten "Cassette multiplication technique", die eine exponentielle Vervielfältigung eines Gens erlaubt, verwendet werden. Diese Ergebnisse sind in Lit. 12 publiziert.
Erstmalig gelang auch die funktionelle Expression eines heterologen Membranproteins in einem Algensystem. Es konnte der Hexose/H+-Symporter aus Chlorella in aktiver Form in Volvox exprimiert werden. Volvox besitzt natürlicherweise kein Zuckertransportsystem. Mit den transgenen Organismen sind nun Pulsmarkierungsexperimente mit radioaktiven Zuckern möglich. Außerdem kann das modifizierte Gen des Hexose/H+-Symporters als negativer Selektionsmarker Verwendung finden, da die entsprechenden Transformanten gegen das Zellgift 2-Deoxyglucose sensitiv werden. Diese Ergebnisse sind in Lit. 5 publiziert.
In weiteren Experimenten konnten für das Modellsystem Volvox auch regulierbare oder regulierte Promotoren (Promotoren des Arylsulfatase-Gens, des ECM-Glykoproteins ISG, des Pherophorin-S-Gens und des DZ-HRGP-Gens) und leicht nachweisbare Reportergene (Arylsulfatase-Gen und Sexualpheromon-Gen) gefunden werden. Diese Ergebnisse sind in Lit. 2, 3, 7 und 13 publiziert.
Eines der wichtigsten Ziele bei der weiteren Verbesserung der genetischen Manipulierbarkeit von Volvox ist die Etablierung von Gen-"Knockouts". Diesem Ziel sind wir bereits einen großen Schritt näher gekommen. Es gelang der erstmalige Nachweis homologer Rekombinationsereignisse. Unter anderem wurde eine Volvox-Mutante mit einem definierten Defekt im Nitratreduktasegen durch ein intaktes Nitratreduktasegen-Fragment mittels homologer Rekombination repariert. Damit sind wichtige Voraussetzungen für die Etablierung eines Gen-"Knockouts" erfüllt. Diese Ergebnisse sind in Lit. 8 publiziert.
Mit den beschriebenen technischen Entwicklungen sollte in den nächsten Jahren eine detailliertere molekulargenetische Analyse der Entwicklung von Volvox möglich sein. Auch bilden diese Neuerungen eine wichtige Basis für die Etablierung vergleichbarer Techniken bei anderen Volvocales wie Gonium, Pandorina, Eudorina und Pleodorina. In Chlamydomonas wird bereits eine Vielzahl molekularbiologischer Techniken angewandt.

 

Die Embryonalentwicklung: ein stark reguliertes Protein organisiert die ECM-Biosynthese

Bei in vivo-Pulsmarkierungsexperimenten mit radioaktivem Sulfat wurde in Volvox-Embryonen ein Protein mit erstaunlichen Eigenschaften gefunden: das ISG. Das ISG ist ein sulfatiertes, extrazelluläres Glykoprotein, das nur für etwa 10 min am Ende der Embryogenese während eines morphogenetischen Prozesses synthetisiert wird, der als "Inversion" bezeichnet wird. Dabei stülpt sich der Embryo durch eine Serie von Zellbewegungen um, wodurch er die Konfiguration des erwachsenen Organismus erlangt. Die Zellbewegungen der Inversion ähneln denen der Gastrulation beim tierischen Embryo.
Das ISG besteht aus einer N-terminalen globulären Domäne und einer C-terminalen, stäbchenförmigen Extensindomäne mit zahlreichen Ser-(Hyp)4-6 Wiederholungen. Obwohl das ISG nur für einen sehr kurzen Zeitraum im 48-Stunden-Lebenszyklus von Volvox synthetisiert wird, bleibt es doch für mindestens 24 h stabil. Mit Immunogold-Transmissionselektronenmikroskopie konnte das ISG in Volvox-Embryonen lokalisiert werden: es befindet sich auf der Oberfläche der somatischen Zellen und dort insbesondere an den Basen der Flagellen. Das ISG ist offensichtlich die allererste ECM-Komponente die gebildet wird. Transgene Volvox wurden erzeugt, die eine verkürzte Form des ISG exprimieren. Diese transgenen Organismen zeigen eine völlig desorganisierte ECM in die die Zellen in chaotischer Weise eingebettet sind, was auch ein koordiniertes Schwimmen der Organismen verhindert. Ein Dekapeptid, das der C-terminalen Sequenz des ISG entspricht, verursacht bereits bei geringen Konzentrationen einen ähnlichen Effekt, allerdings nur wenn es während oder kurz nach der embryonalen Inversion zugegeben wird. Fasst man alle Ergebnisse zusammen, so ergibt sich folgende Hypothese: unmittelbar nach der embryonalen Inversion wird ein auf dem ISG basierender Komplex synthetisiert der das erste Netzwerk bildet, das die somatischen Zellen über ihre Flagellen verankert; gleichzeitig dient dieser ISG basierende Komplex als Gerüst auf dem der Rest der ECM aufgebaut wird. Dies ist eine essentielle Funktion, da ohne diesen ISG-basierenden Komplex ein völlig desorganisierter Sphäroid entsteht, der deshalb auch nicht schwimmen kann und so in der Natur nicht überleben könnte. Diese Ergebnisse sind in Lit. 1 und 14 publiziert.

 

Die sexuelle Entwicklung: Synthese von ECM-Proteinen als Antwort auf das Sexualpheromon

Der Auslöser für das Umschalten von der asexuellen zur sexuellen Vermehrung in V. carteri ist ein Sexualpheromon, ein 32kDa-Glykoprotein. Dieses Pheromon ist eines der wirksamsten biologischen Effektor-Moleküle die man kennt: es löst die sexuelle Entwicklung in asexuellen reproduktiven Zellen noch in einer Konzentration von 10-16 M (!) aus. Um diesen Signalverstärkungsmechanismus aufklären zu können, sollen zunächst alle Gene identifiziert werden, die unter der Kontrolle des Pheromons stehen. Durch biochemische Pulsmarkierungsexperimente konnte bereits eine große Familie von Glykoproteinen entdeckt werden, die sich durch eine C-terminale Domäne mit Homologie zum Sexualpheromon auszeichnen, wobei diese Domäne bei einigen Mitgliedern durch spezifische Proteolyse freigesetzt werden kann. Diese Ergebnisse sind in Lit. 4 und 7 publiziert.
Ein weiteres, durch das Sexualpheromon induzierbares Protein, DZ-HRGP genannt, wurde durch differentielles Durchsuchen von cDNA-Banken gefunden. Das DZ-HRGP ist ein ECM-Glykoprotein, das einen Prolin-Gehalt von 68% aufweist. Dabei sind sämtliche Proline hydroxyliert, wodurch das DZ-HRGP das extremste Mitglied der "Hydroxyprolin-reichen Glykoproteine" (HRGPs) darstellt. Diese Ergebnisse sind in Lit. 13 publiziert.
Eine zweite Proteinfamilie wurde gefunden, die ebenfalls unter der Kontrolle des Sexualpheromons steht: die VMP-Proteinfamilie. VMPs sind modulare Metalloproteinasen für den ECM-Umbau. Die ungewöhnliche Aminosäuresequenz an der Zink-Bindestelle aller VMPs (QEXXHXXGXXH) legt nahe, für die VMPs einen neuen Clan von Peptidasen zu begründen. Diese Ergebnisse sind in Lit. 15 publiziert.
Erstaunlicherweise waren alle bislang identifizierten Gene, die unter der Kontrolle des Sexualpheromons synthetisiert wurden, auch durch Verletzung induzierbar. Dieser Befund zeigt, dass sich das sexuelle Pheromonsystem ähnlicher Signaltransduktionswege bedient wie die Antwort auf Verletzungen und damit als Teil einer allgemeinen Stressreaktion interpretierbar ist.

 

Induzierbare ECM-Enzyme als Antwort auf umgebungsbedingten Stress

In der ECM von Volvox konnten auch zwei durch umgebungsbedingten Stress induzierbarer Enzyme identifiziert werden. Bei dem einen Enzym handelt es sich um eine SDS-beständige, extrazelluläre Arylsulfatase mit einer evolutionär konservierten Proteinmodifikation (Formylglycin). Diese Ergebnisse sind in Lit. 2 und 6 publiziert. Bei dem anderen Enzym handelt es sich um eine extrazelluläre, Calcium-abhängige Phosphatase mit einem auffälligen, modularen Aufbau. Diese Ergebnisse sind in Lit. 11 publiziert.

 

Eigene Veröffentlichungen:

1. Ertl, H., Hallmann, A., Wenzl, S. & Sumper, M. (1992). A novel extensin that may organize extracellular matrix biogenesis in Volvox carteri. EMBO J. 11, 2055-2062.

2. Hallmann, A. & Sumper, M. (1994). An inducible arylsulfatase of Volvox carteri with properties suitable for a reporter-gene system. Purification, characterization and molecular cloning. Eur. J. Biochem. 221, 143-150.

3. Hallmann, A. & Sumper, M. (1994). Reporter genes and highly regulated promoters as tools for transformation experiments in Volvox carteri. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11562-11566.

4. Godl, K., Hallmann, A., Rappel, A. & Sumper, M. (1995). Pherophorins: a family of extracellular matrix glycoproteins from Volvox structurally related to the sex-inducing pheromone. Planta 196, 781-787.

5. Hallmann, A. & Sumper, M. (1996). The Chlorella hexose/H+ symporter is a useful selectable marker and biochemical reagent when expressed in Volvox. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 669-673.

6. Selmer, T., Hallmann, A., Schmidt, B., Sumper, M. & von Figura, K. (1996). The evolutionary conservation of a novel protein modification, the conversion of cysteine to serinesemialdehyde in arylsulfatase from Volvox carteri. Eur. J. Biochem. 238, 341-345.

7. Godl, K., Hallmann, A., Wenzl, S. & Sumper, M. (1997). Differential targeting of closely related ECM glycoproteins: the pherophorin family from Volvox. EMBO J. 16, 25-34.

8. Hallmann, A., Rappel, A. & Sumper, M. (1997). Gene replacement by homologous recombination in the multicellular green alga Volvox carteri. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 7469-7474.

9. Sumper, M. & Hallmann, A. (1998). Biochemistry of the extracellular matrix of Volvox. Int. Rev. Cytol. 180, 51-85.‡

10. Hallmann, A., Godl, K., Wenzl, S. & Sumper, M. (1998). The highly efficient sex inducing pheromone system of Volvox. Trends Microbiol. 6, 185-189.‡

11. Hallmann, A. (1999). Enzymes in the extracellular matrix of Volvox: an inducible, calcium-dependent phosphatase with a modular composition. J. Biol. Chem. 274, 1691-1697.

12. Hallmann, A. & Rappel, A. (1999). Genetic engineering of the multicellular green alga Volvox: a modified and multiplied bacterial antibiotic resistance gene as a dominant selectable marker. Plant J. 17, 99-109.

13. Ender, F., Hallmann, A., Amon, P. & Sumper, M. (1999). Response to the sexual pheromone and wounding in the green alga Volvox: induction of an extracellular glycoprotein consisting almost exclusively of hydroxyproline. J. Biol. Chem. 274, 35023-35028.

14. Hallmann, A. & Kirk, D. L. (2000). The developmentally regulated ECM glycoprotein ISG plays an essential role in organizing the ECM and orienting the cells of Volvox. J. Cell Sci. 113, 4605-4617.

15. Hallmann, A., Amon, P., Godl, K., Heitzer, M. & Sumper, M. (2001). Transcriptional activation by the sexual pheromone and wounding: a new gene family from Volvox encoding modular proteins with (hydroxy)proline-rich and metalloproteinase homology domains. Plant J. (in press).

‡ Review.

 

Arbeitsprogramm (Ziele, Methoden, Zeitplan)

Nachstehend sind die im Antragszeitraum zu bearbeitenden Punkte aufgeführt:

1. Etablierung der Algenzucht für Gonium, Pandorina, Eudorina und Pleodorina und Entwicklung von Transformationssystemen für diese Organismen

2. Identifikation und Charakterisierung weiterer ECM/Zellwand-Komponenten als Strukturelemente und Enzyme. Ausbreitung der Pherophorin-Proteinfamilie.

3. Extrazelluläre Lokalisation von ECM/Zellwand-Proteinen

4. Die VMP-Proteinfamilie

 

Zu 1: Etablierung der Algenzucht für Gonium, Pandorina, Eudorina und Pleodorina und Entwicklung von Transformationssystemen für diese Organismen

Die Kultivierung von Chlamydomonas und Volvox (carteri) ist seit Jahren optimiert. Ebenso sind beide Organismen für vielfältige genetische Manipulationen zugänglich. Die Zucht von Gonium, Pandorina, Eudorina oder Pleodorina muss erst etabliert werden; genetische Manipulationen wurden an diesen Organismen noch nie vorgenommen. Langfristig soll darum versucht werden das bereits verfügbare molekulargenetische Repertoire von Volvox und Chlamydomonas auch für die anderen Volvocales nutzbar zu machen. Zunächst wird aber erst erforderlich sein von diesen Organismen jeweils mindestens einen arteigenen Promotor (vom -Tubulin-Gen) und einen arteigenen Selektionsmarker (Nitratreduktasegen) zu klonieren. Dies soll mittels PCR (degenerierte Primer) geschehen. Für die Transformation aller Volvocales soll die "Particle gun" verwendet werden.

 

Zu 2: Identifikation und Charakterisierung weiterer ECM/Zellwand-Komponenten als Strukturelemente und Enzyme. Ausbreitung der Pherophorin-Proteinfamilie.

In den vergangenen Jahren konnten bereits einige ECM/Zellwand-Proteine aus dem Vielzeller Volvox bzw. aus dem Einzeller Chlamydomonas kloniert werden. Dabei zeigte sich, dass sowohl in Volvox als auch in Chlamydomonas modulare Glykoproteine an den extrazellulären Strukturen maßgeblich beteiligt sind. Aufgrund der Komplexität insbesondere der Volvox-ECM reichen diese Ergebnisse aber nicht aus um allgemeine Prinzipien für die Entwicklung zur Vielzelligkeit abzuleiten.
Im Antragszeitraum sollen nun erstmals mittels proteinchemischer Techniken auch Zellwand/ECM-Glykoproteine aus den Volvocales Gonium, Pandorina, Eudorina bzw. Pleodorina isoliert, ansequenziert (Teilprojekt Z2), kloniert und charakterisiert werden. Auch die Zellwand bzw. ECM von Chlamydomonas und Volvox soll weiter proteinchemisch analysiert werden. Durch die seit kurzem vorhandene "expressed sequence tags - EST"-Datenbank für Chlamydomonas reinhardtii sollte eine Klonierung von Zellwand-Glykoproteinen aus Chlamydomonas wesentlich erleichtert sein.
In den vergangenen Jahren wurde in Volvox carteri eine Familie von ECM-Glykoproteinen identifiziert die entwicklungskontrolliert, genauer gesagt als Antwort auf das Sexualpheromon, synthetisiert werden: Die Pherophorine. Pherophorine bestehen aus zwei globulären Domänen, die durch einen stäbchenförmigen, Hydroxyprolin-reichen Spacer verbunden sind. Dabei variiert der Spacer bei den unterschiedlichen Pherophorinen extrem stark in der Länge. Ständig werden in Volvox neue Mitglieder dieser Familie gefunden (z.T. noch nicht publiziert), darunter auch solche, die konstitutiv exprimiert werden. Mittlerweile sind ca. 15 Pherophorine bekannt. Es stellt sich die Frage, ob es sich bei diesen ECM-Glykoproteinen um wesentliche Strukturelemente der ECM des Vielzellers handelt. Man könnte sich ein Ur-Pherophorin im Einzeller vorstellen, aus dem auf dem Weg zur Vielzelligkeit durch eine hohe Variabilität vor allem im Hydroxyprolin-reichen Spacer Pherophorine mit ganz verschiedenen Eigenschaften hervorgingen, ein Vielfalt an Eigenschaften wie sie von der komplex strukturierten ECM des Vielzellers Volvox gefordert werden. Um diese Möglichkeit zu überprüfen, soll nun auch gezielt nach Pherophorin-Verwandten in den weniger hoch entwickelten Volvocales gesucht werden.

 

Zu 3: Extrazelluläre Lokalisation von ECM/Zellwand-Proteinen

Es ist geplant, bereits klonierte ECM/Zellwand-Glykoproteine der Volvocales (ISG, VMPs, GAS28, GP1, ....) auf Genebene mit einem GFP-Tag zu versehen, um die Genprodukte dann in den entsprechenden Transformanten in vivo optisch detektieren zu können. Von Bedeutung ist dabei nicht nur die genaue Lokalisation innerhalb der ECM/Zellwand, sondern auch wann in der Entwicklung die entsprechenden Komponenten gebildet werden. Wechselwirkungen zwischen verschiedenen ECM/Zellwand-Komponenten könnten auch durch Doppelmarkierungen (z.B. unterschiedlich fluoreszierende GFPs) untersucht werden. Bezüglich Transformierbarkeit, funktioneller GFP-Variante, Selektionsmarker, vorhandener Promotoren etc. sind die technischen Voraussetzungen für diese Experimente für Volvox und Chlamydomonas bereits jetzt gegeben. Das vom Sonderforschungsbereich 521 beantragte konfokale Laser-Scanning-Mikroskop wäre für diese Experimente dringend erforderlich, da bei der nicht-konfokalen Fluoreszenzmikroskopie mit den sphäroidalen Volvocales aufgrund ihrer großen Dimensionen Streulicht erhebliche Problem verursacht, was die Aufklärung von Feinstrukturen praktisch ausschließt. Mit dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop könnten auch optische Schnitte gemacht werden, was anders kaum realisierbar ist.
Aus den Lokalisationsuntersuchungen erwarten wir uns Aufschlüsse über die ECM/Zellwand-Biogenese an sich und die Funktion einzelner Komponenten im besonderen.

 

Zu 4: Die VMP-Proteinfamilie

Die kürzlich in Volvox identifizierte Metalloproteinase-Familie der VMPs wird unter der Kontrolle des Sexualpheromons synthetisiert. Wie die Matrixin-Familie der menschlichen Collagenasen besitzen auch die VMPs eine modulare Struktur: sie haben eine Metalloproteinase-Domäne, eine (Hydroxy-)Prolin-reiche Domäne, und eines, VMP4, hat sogar noch zwei weitere Domänen. VMPs werden vermutlich für den entwicklungsabhängigen ECM-Umbau benötigt. Die ungewöhnliche Aminosäuresequenz an der Zink-Bindestelle aller VMPs (QEXXHXXGXXH anstatt HEXXHXXGXXH) legt nahe, für die VMPs einen neuen Clan von Peptidasen zu begründen. Dabei ist zunächst vor allem die Bedeutung der einzelnen Aminosäuren an der Zinkbindestelle und insbesondere die des ersten Glutamins (anstatt sonst Histidin) in der Konsensus-Sequenz zu klären. Dies soll durch einzelne Aminosäureaustausche aufgeklärt werden. Zur Vorbereitung dieses Experiments soll aber zunächst eine im (Hydroxy )Prolinteil leicht verkürzte, aber ansonsten voll funktionsfähige VMP-Variante hergestellt werden, weil die Protease-Tests im Gel stattfinden werden und durch die Verkleinerung eine leichte Unterscheidung des modifizierten Proteins zum Wildtyp-Protein möglich wird. Anschließend sollen dann die Aminosäureaustausche an dieser Variante durchgeführt werden. Erste Versuche haben gezeigt, dass die VMPs, wenn sie heterolog exprimiert werden, nicht funktionell sind, was es nötig machen wird alle Expressionen homolog in Volvox durchzuführen.
Von großer Bedeutung ist auch die genaue Enzymspezifität der VMPs herauszufinden und das natürliche Substrat zu identifizieren. Dazu sollen verschiedene, radioaktiv markierte ECM-Extrakte als potentielle Substrate getestet werden.
Im weiteren Verlauf soll auch geklärt werden, ob in einzelligen bzw. weniger hoch entwickelten Volvocales bereits eine vergleichbare Enzymausstattung vorhanden ist.

 

 

 


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