Die Rezeptor Tyrosinkinase Met ist essentiell in der Entwicklung von Vertebraten und spielt im Adulten eine bedeutende Rolle bei Geweberegeneration und Wundheilung. Daneben ist Met auch in Infektionsprozesse durch mikrobielle Pathogene involviert. Das fakultativ intrazelluläre Bakterium Listeria monocytogenes aktiviert Met, um seine Aufnahme in nicht-phagozytierende Zellen zu erreichen. Verantwortlich für die Rezeptoraktivierung ist InlB, ein bakterielles Oberflächenprotein, das spezifisch an die extrazelluläre Domäne von Met bindet. Obwohl InlB strukturell keinerlei Ähnlichkeit mit dem physiologischen Met-Liganden HGF/SF hat, ist die zelluläre Antwort auf Stimulation von Met durch HGF/SF und InlB sehr ähnlich.
Unser Ziel ist es, den Mechanismus der Liganden-induzierten Met Aktivierung auf molekularer Ebene aufzuklären. Dazu haben wir die Struktur eines Komplexes aus InlB und der Ektodomäne von Met bestimmt (oberes Bild, Niemann et al. 2007). Dieser Komplex zeigt, dass die Bindungsstellen für InlB und HGF/SF sich unterscheiden. Ein Vergleich des Komplexes mit weiteren Strukturen legt nahe, dass InlB eine Konformationsänderung der Met Ektodomäne bewirken kann. Die Bindung von InlB an den Met Rezeptor bewirkt eine Dimerisierung, die durch einen Kontakt auf der konvexen Seite von InlB vermittelt wird (mittleres Bild, Ferraris et al. 2010).
Met ist ein medizinisch interessantes Zielmolekül. Eine gezielte Hemmung von Met bietet einen Ansatz für die Behandlung verschiedener Tumoren. Eine gezielte Aktivierung könnte in der Geweberegeneration eingesetzt werden. Rezeptor Tyrosinkinasen werden durch Liganden-induzierte Dimerisierung aktiviert. Die Kenntnis der strukturellen Grundlage der durch InlB ausgelösten Dimerisierung von Met ermöglicht eine gezielte, Strutkur-basierte Entwicklung von Met Agonisten (unteres Bild).
In der PDB hinterlegte Strukturen
2UZX - InlB/Met Komplex; deglycosyliertes Protein, 2.8 Å Auflösung
2UZY - InlB/Met Komplex; glycosyliertes Protein, 4.0 Å Auflösung
2WQU - InlB Internalin Domäne, trikline Kristallform, 2.6 Å Auflösung
2WQV - InlB Internalin Domäne, rhomboedrische Kristallform 2.8 Å Auflösung
2WQW - InlB Internalin Domäne, Disulfid-verbrücktes Dimer, 2.24 Å Auflösung
2WQX - InlB Internalin Domäne, nicht-aktivierende Mutante, 2.0 Å Auflösung
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Typ III Sekretionssyteme (T3SS) sind große Multiproteinkomplexe, die von vielen pathogenen und symbiontischen Gram-negativen Bakterien verwendet werden, um Effektorproteine direkt in das Zytoplasma von Wirtszellen zu injizieren. Die meisten Effektoren benötigen ein spezifisches Chaperon für die effektive Translokation, wobei das Chaperon selber im bakteriellen Zytoplasma verbleibt. Anders als klassische Chaperone binden T3S Chaperone kein Nukleotid. Verschiedene Funktionen werden diskutiert. Dazu gehören die Zielführung zum Nadelkomplex oder die Aufrechterhaltung eines teilweise entfalteten translokationskompetenten Zustands.
Klasse I Chaperone
Wir haben die Struktur des Klasse I Chaperons SycT aus Yersinia enterocolitica in mehreren Kristallformen bestimmt (Büttner et al. 2005). Diese Strukturen geben Hinweise auf möglicherweise für die Effektorbindung nötige Konformationsänderungen, die bisher in keinem der homologen Chaperone mit ähnlicher Faltung beobachtet wurden.
In der PDB hinterlegte Strukturen
2BSH - SycT; C-terminal verkürzt; Kristallform II (hexagonal), 1.9 Å Auflösung
2BSI - SycT; C-terminal verkürzt; Kristallform I (orthorhombisch), 2.0 Å Auflösung
2BSJ - SycT; 1.83 Å Auflösung
Klasse II Chaperone
Die Klasse II Chaperone von Typ III Sekretionssystemen binden Translokator Proteine, die bei Kontakt mit der Wirtszelle eine Pore in deren Plasmamembran bilden. Strukturell haben T3S Chaperone der Klassen I und II nichts gemein. Wir haben die erste Struktur eines T3S Chaperons der Klasse II experimentell bestimmt (Büttner et al. 2008). Die Struktur von SycD aus Y. enterocolitica zeigt Tetratrico Peptide Repeats und gibt Hinweise auf die Bindungsstellen für die Translokatorproteine YopB und YopD. Die Dimerisierung von SycD und anderen T3S Klasse II Chaperonen ist funktionell relevant und Gegenstand weiterer Forschung.
In der PDB hinterlegte Strukturen
2VGX - SycD; N- u. C-terminal verkürzt, Lysine methyliert, 1.95 Å Auflösung
2VGY - SycD; N- u. C-terminal verkürzt, Lysine methyliert, S94E/Y95E Mutante, 2.6 Å
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Fusionsproteine mit großen Tags (z.B. GST oder MBP) werden in der Regel nur genutzt, um während der Proteinexpression die Löslichkeit zu erhöhen und anschließend eine Affinitätsreinigung zu ermöglichen. Vor der Kristallisation werden diese großen Tags meist proteolytisch entfernt. Wir haben anhand von zwei Beispielen gezeigt, dass die Fusion von Zielproteinen an große Domänen wie die Motordomäne von Myosin II (Niemann et al. 2001) oder die RNAse Barnase (Niemann et al. 2006) die Kristallisation begünstigen kann und die Lösung des Phasenproblems über molekularen Ersatz erlaubt.
Auf diese Weise haben wir die erste Struktur einer Dynamin GTPase-Domäne bestimmt (Niemann et al. 2001).
In der PDB hinterlegte Strukturen
1JWY - Fusionsprotein:
MyosinII Motordomäne & DynaminA GTPase Domäne; GDP-gebunden, 2.3 Å Auflösung
1JX2 - Fusionsprotein:
MyosinII Motordomäne & DynaminA GTPase Domäne; nukleotidfrei, 2.3 Å Auflösung
2C4B - Fusionsprotein:
Barnase & McoEeTI ; 1.3 Å Auflösung
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