© Universität Bielefeld
Lyse ( = Aufbrechen der Zellen)
Es stehen zwei verschiedene Lysepuffer zur Auswahl: PL1 basiert auf dem Standardprotokoll für Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB), PL2 auf Natriumdodecylsulfat (SDS). Beide sind Detergenzien, d.h. sie verändern Molekülstrukturen. Beim Aufbrechen der Zellen wird die Sekundär- und Tertiärstruktur der Membranproteine zerstört. Pflanzen sind sehr unterschiedlich und können Polyphenole, verschiedene Metabolite, Polysaccharide oder saure Komponenten enthalten. Da es sich bei CTAB um ein kationisches Tensid, bei SDS um ein anionisches Tensid handelt, kann es bei diversen Pflanzenproben durch das unterschiedliche Lösungsverhalten zu verschiedenen Ergebnissen kommen. Für die Orchideen unseres Versuchstages haben sich beide Puffer als geeignet erwiesen. Sie müssen 10 Minuten lang bei 65°C einwirken.
Zu den Proben mit den Lysepuffern werden 10 µl Ribonuklease A (RNase A) zugegeben. Dieses Enzym zerschneidet spezifisch RNA. Dabei wird die hydrolytische Spaltung der Phosphodiesterbindungen der RNA katalysiert. Auf diese Weise wird die RNA zerstört und bei den in der Probe enthaltenen Nukleinsäuren handelt es sich zum Schluss der Extraktion nur noch um intakte DNA.
Filtrieren
Die Proben werden durch Zentrifugieren durch den Mikrofilter (sichtbar als weißes Gewebe, zur Unterscheidung mit violettem Ring) hindurch gedrückt. Zelltrümmer werden zurück gehalten. Die durchgeflossene Flüssigkeit enthält die gewünschte DNA.
Vorgang an der Nukleospin-Säule
Bindungspuffer
Der Durchfluss wird durch Zufügen des Bindungspuffer PC für das Binden an einer Kieselsäuremembran vorbereitet. Er enthält das chaotrope Guanidinhydrochlorid. Dies löst und denaturiert alle biochemischen Substanzen mit Ausnahme von Nukleinsäuren. Außerdem binden diese in Gegenwart hoher Konzentrationen chaotrope Salze an Silikaoberflächen.
Nukleospin-Säule
Der Durchfluss wird auf eine für die DNA-Bindung optimierte Kieselsäuremembran gegeben, an welche die DNA bindet.
Waschen
Mit Hilfe von zwei verschiedenen Waschpuffern, PW1 und PW2, werden in drei Waschschritten mit zwischengeschalteter Zentrifugierung Verunreinigungen aus der Probe heraus gereinigt. PW1 enthält Guanidinhydrochlorid und Isopropanol, PW2 wird mit Ethanol angesetzt, genauere Inhaltsstoffe werden nicht angegeben. Ethanol fällt Nukleinsäuren in Gegenwart von Salzen wie etwa einwertigen Kationen Na+ aus.
Elutionspuffer
Zum Ablösen der DNA von der Nukleospin-Säule wird der Niedrigsalzpuffers PE auf die Säule pipettiert. Unter Niedrigsalzbedingungen werden die Wechselwirkungen zwischen den DNA-Molekülen und der Kieselsäure destabilisiert. Nach einer Einwirkzeit von 5 Minuten bei 65°C wird die Probe zentrifugiert und so das erste Eluat gewonnen. Dieser Schritt kann wiederholt werden, so dass man ein zweites Eluat erhält. Durch eine Messung im nano-drop kann geprüft werden, wieviel DNA die Proben enthalten.