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  • teutolab-biotechnologie

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Primer

Für jede PCR-Reaktion wird für die beiden komplementären Stränge jeweils ein Primer benötigt, d.h., in die Reaktionen müssen immer Primerpaare eingesetzt werden. Es handelt sich um Oligonukleotide von 18-30 Nukleotiden Länge. Ihre Basenfolge darf nur einmal in der gesamten DNA vorkommen, sonst wirken sie nicht mehr spezifisch für den gewünschten DNA-Abschnitt. Biotechnologiefirmen synthetisieren Primer in definierter Basenfolge. Welche Zusammensetzung geeignet ist, kann man mit Hilfe diverser im Internet angebotener Tools ermitteln lassen oder aber aus Veröffentlichungen entnehmen.

Die Hybridisierungstemperatur hängt von der Länge und vom G/C-Gehalt der Primer ab. Längere Primer und eine höhere Anzahl von Guanin- und Cytosin-Paarungen mit drei Wasserstoffbrücken erfordern höhere Temperaturen als kürzere Primer und eine höhere Anzahl von Adenin- und Thymin-Paarungen mit nur zwei Wasserstoffbrücken.

Taq-Polymerase

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DNA-Polymerasen katalysieren die Verknüpfung von (Desoxyribo)nukleotiden und somit die Neusynthese komplementärer Stränge (vgl. Abb. 2). Diese Enzyme sind maßgeblich für die DNA-Replikation in der Zelle verantwortlich.

Taq-Polymerase ist eine hitzestabile DNA-Polymerase. Sie wurde in Thermus aquaticus, einem in heißen Quellen des Yellowstone-Nationalparks lebenden Bakterium, entdeckt. Taq-Polymerase hat ein Temperaturoptimum von etwa 72°C und sie ist bei Temperaturen knapp unter 100°C noch sehr stabil. Für die PCR spielt sie eine wichtige Rolle: Sie übersteht die für die Denaturierung erforderlichen hohen Temperaturen von etwa 95°C und die Polymerisationstemperatur von etwa 72°C leitet sich vom Temperaturoptimum des Enzyms ab.

Mastermix

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Im Mastermix ist alles enthalten, was man bei jeder PCR identisch benötigt: Die Nukleotide liegen als Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTP) aller vier Basen Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin vor (vgl. Abb. 3). Es ist das die Polymerisation katalysierende Enzym Taq-Polymerase enthalten und das Magnesiumsalz MgCl2 , welches als Cofaktor für die Polymerase benötigt wird. Taq-Polymerase wurde in dem Bakterium Thermus aquaticus entdeckt, das in heißen Quellen im Yellowstone Nationalpark lebt. Es übersteht die hohen Denaturierungstemperaturen unbeschadet und hat ein Temperaturoptimum von 72°C. Diese Temperatur wird daher für die Polymerisation angewendet (Weitere Infos zum PCR-Programm und dem PCR-Zyklus).

Biotechnologiefirmen bieten verschiedene fertige Mastermixe an, man kann sie aber auch selbst zusammenmixen.

PCR Zyklus

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Um einen bestimmten DNA-Abschnitt gezielt zu vervielfältigen, werden drei entscheidende Teilschritte im Laufe der PCR (= Polymerasekettenreaktion) zyklisch wiederholt (siehe auch PCR-Programm), sodass im Laufe jedes Zyklus eine Verdoppelung des relevanten DNA-Abschnitts erfolgt. Die einzelnen Teilschritte laufen bei unterschiedlichen Temperaturen ab.

Denaturierung bei 94-96°C: Die komplementären Doppelstränge werden bei dieser hohen Temperatur entlang der Wasserstoffbrückenbindungen voneinander getrennt, also denaturiert, sodass sie als Einzelstränge vorliegen.

Hybridisierung bei 50-60°C: Die Primer lagern sich an die Einzelstränge an, indem Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären Nukleinbasen ausgebildet werden.

Polymerisation bei 70-74°C: Die hitzestabile Taq-Polymerase arbeitet bei dieser Temperatur optimal und synthetisiert den neuen Strang, indem sie die komplementär bindenden Nukleotide (dNTP´s) verknüpft.

 

Die Taq-Polymerase, freie Nukleotide (dNTP´s) und weitere nötige Chemikalien sind im sogenannten Mastermix enthalten.

PCR-Programm

Das Gerät, in dem die PCR abläuft, ist ein Thermoycler, d.h. definierte Temperaturen werden zyklisch nacheinander geschaltet. Die einzelnen Schritte der PCR sind im Display des Thermoyclers erkennbar:

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In dem hier abgebildeten PCR-Programm wird zuerst die DNA einmalig 15 Minuten lang denaturiert. Es folgen die zyklisch wiederholten Schritte Denaturierung bei 94°C, Hybridisierung bei 53°C und Polymerisation bei 72°C. Dieser Ablauf wird 32 Mal wiederholt. Im Anschluss erfolgt eine finale Polymerisation bei 72°C.

Kannst Du die Dauer der einzelnen Schritte des PCR-Zyklus erkennen?

Die Hybridisierungstemperatur wurde passend für die verwendeten Primer eingestellt. Wenn ein Versuch entwickelt wird, werden bei Problemen bei der PCR andere Temperaturen ausgetestet. Die Denaturierung und die Polymerisation haben einen Spielraum von 94-96°C bzw. 70-74°C, in dessen Bereich diese Schritte recht sicher ablaufen. Eine zu kurze Dauer kann aber problematisch werden. Daher lässt man sie zur Sicherheit lieber etwas länger laufen und wartet bis zu 90 Minuten auf das Programmende.


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