teutolab-biotechnologie

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Viren - Das geliehene Leben

Viren sind mit einer Größe von 15 bis 400 nm sehr klein. Es gibt viele unterschiedliche Arten von Viren, welche sich auch in ihrem Aussehen sehr unterscheiden. Die DNA der Viren wird durch eine Hülle aus Proteinen geschützt, welche oftmals geometrischen Körpern gleichen. Im Folgenden sind verschiedene Viren im Vergleich zu einem Bakterium dargestellt.

Viren sind jedoch keine Lebewesen, sie können sich lediglich „als Untermieter“ in anderen Organismen vermehren. Dies liegt daran, dass sie keinen eigenen Stoffwechsel besitzen und somit auf den der Wirtszelle angewiesen sind. Gelangt also ein Virus in eine Zelle, so können von dieser Zelle neue Viren gebildet werden.

Viren sind dafür bekannt, Krankheiten zu erzeugen. Beim Menschen reicht dies von einfachem Schnupfen bis hin zur tödlich verlaufenden Immunschwächekrankheit AIDS. Auch stehen einige Viren im Verdacht, an der Entstehung von bestimmten Krebserkrankungen beteiligt zu sein. Jedoch gibt es auch Viren, welche für den Menschen keine Gefahr darstellen. Beispielsweise können Bakteriophagen ausschließlich Bakterien befallen. Dabei lassen sie ihre Proteinhülle außerhalb der neuen Wirtszelle zurück und injizieren nur ihre DNA.

Am Versuchstag im teutolab-biotechnologie wird der Lambda-Phage untersucht.

Nach der Adsorption an eine Wirtszelle mit der Basalplatte des Schwanzes injiziert er die DNA in die Zelle. Innerhalb der Wirtszelle kann es nun zu zwei unterschiedlichen Abläufen kommen: Zum lytischen oder zum lysogenen Zyklus.

Isolierung der DNA

Um DNA zu isolieren, müssen die Zellen zuerst lysiert, also aufgeschlossen werden. Dazu können mechanische oder auch nicht-mechanische Verfahren angewendet werden. Bei den mechanischen Verfahren werden Gewebe und Zellstrukturen durch Krafteinwirkungen zerstört. Sie können z. B. mit einem Pistill zerrieben werden oder durch winzige Kügelchen in Kugelmühlen zerschlagen werden. Bei den rein chemischen Verfahren werden winzige Gewebeteile in geeignete Pufferlösungen gegeben, welche die Zellwände und –membranen angreifen. Sie enthalten Detergenzien, die die Grenzflächenspannung herabsetzen. Ein häufig verwendetes Detergens ist Sodiumdodecylsulfat (SDS). Es wird auch Wasch- und Reinigungsmitteln zugesetzt.

Am Versuchstag im teutolab-biotechnologie werden die Zellen durch alkalische Lyse aufgebrochen. Dazu werden die Zellen in einen Lysepuffer gegeben, welcher Natronlauge (NaOH) und SDS enthält. Die Proben werden bei 98° C inkubiert, also quasi gekocht. Durch den stark alkalischen pH-Wert, das Detergens und die hohe Temperatur werden die Zellmembranen aufgebrochen und die gewünschte DNA wird freigesetzt. Die DNA kann dabei in mehrere Fragmente zerrissen werden. Im Anschluss daran wird eine Zentrifugation durchgeführt um die DNA von den anderen Bestandteilen der Zelle zu trennen. Dabei entsteht das Zell-Pellet, welches die schwereren Zell-Fragmente enthält. Im Puffer bleiben somit die restlichen DNA-Fragmente sowie einige leichte Zellorganellen zurück und können dann abpipettiert und weiterverwendet werden. In Abbildung 1 ist der gesamte Vorgang der Zell-Lyse abgebildet.

Restriktionsspaltung

Die Restriktionsanalyse ist ein Verfahren zur Analyse von DNA und kann für verschiedene Bereiche wie Charakterisierung, Identifizierung und Isolierung eingesetzt werden. Dabei wird die DNA von einem Restriktionsenzym gespalten. Dies erfolgt an einer spezifischen Erkennungssequenz aus Basenpaaren, welche das Restriktionsenzym erkennt. Diese Erkennungssequenzen sind je nach Restriktionsenzym zwischen vier und acht Basenpaaren lang. Die gezielte Spaltung von DNA an definierten Basenfolgen kann zur Detektion von Mutationen genutzt werden. Ist die entsprechende Basenabfolge vorhanden, so wird die DNA geschnitten und es entstehen entsprechend viele DNA-Fragmente (immer eins mehr als Erkennungssequenzen vorhanden sind). Die Länge der Fragmente hängt von der Lage der Erkennungssequenzen auf der Ursprungs-DNA ab. Dies kann zur Restriktionsfragmentanalyse genutzt werden. Dadurch können z. B. Tierarten oder Viren genetisch voneinander unterscheiden zu können. 

Die Abbildung zeigt das Prinzip anhand des Restriktionsenzyms Tsp 5091 mit der Erkennungssequenz AATT.

Polymerase-Kettenreaktion

Bei der PCR wird DNA vervielfältigt (= amplifiziert). Bei den meisten Untersuchungen wird nicht die gesamte DNA, sondern ein bestimmter, für die gegebene Fragestellung sinnvoller DNA-Abschnitt amplifiziert. Geeignete Primer binden spezifisch und bilden den gewünschten Startpunkt für die Neusynthese von komplementären Strängen. In der PCR wird dieser Vorgang durch die Taq-Polymerase katalysiert. So entstehen komplementäre neu synthetisierte DNA-Stränge. In einem PCR-Reaktionsmix werden also die DNA des untersuchten Organismus,  Primer(mix), Mastermix und Wasser zusammen pipettiert. Sie läuft nur unter geeigneten Reaktionsbedingungen in einem Thermocycler ab. Dabei ist der PCR-Zyklus grundsätzlich derselbe, aber das PCR-Programm muss spezifisch ausgewählt werden.

Gelelektrophorese

Bei der Gelelektrophorese werden DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge ihrer Größe nach aufgetrennt. Legt man Gleichspannung an die Enden eines Agaorese-Gels und überschichtet es mit einer Pufferlösung, so wandert die DNA zum Pluspol (Anode). Die kleineren DNA-Stücke wandern schneller durch das Gel als die großen und langen Stücke, sodass im Laufe der Gelelektrophorese eine Auftrennung der DNA-Proben entsprechend ihrer Länge und somit auch Anzahl der Basenpaare erfolgt. Außer der Fragmentgröße hat auch die Stärke der Spannung und die Konzentration des Gels Einfluss auf die Wanderung der geladenen Teilchen. Damit die Größe der aufgetrennten DNA-Fragmente exakt bestimmt werden kann, lässt man daher einen DNA-Längenstandard mit Fragmenten bekannter Größe mitlaufen. Um die farblose DNA sichtbar zu machen, muss eine Anfärbung erfolgen.

Transmissionselektronenmikroskop (TEM)

Bei einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) wird ein dünner Elektronenstrahl zum Abbilden von Objekten genutzt. Er durchdringt das Objekt ebenso wie das Licht beim Lichtmikroskop.

Am Kopf befinden sich zwei Elektroden, eine Kathode und eine Anode. Die Anode ist positiv geladen, während die Kathode negativ geladen ist. Als Kathode wird im TEM ein kleiner Draht eingesetzt, welcher als Elektronendonator dient. Als Anode kommt eine Platte mit einem winzigen Loch in der Mitte zum Einsatz. Wird der Draht unter Spannung gesetzt, gibt er Elektronen ab, welche von der Anode angezogen werden. Hier werden Spannungen von 70kV bis 120kV genutzt. In der Anode befindet sich ein Loch, durch das der Elektronenstrahl durchgelassen wird. So entsteht der Elektronenstrahl. Damit es nicht zu einer Wechselwirkung zwischen den Elektronen und Gasmolekülen kommt, herrscht im Transmissionselektronenmikroskop ein Vakuum.

Die durch das Vakuum schießenden Elektronen werden von Magnetfeldern in der Bahn gehalten. Diese Magnetfelder werden von mehreren Spulen erzeugt, welche sich über das TEM verteilt befinden.

Unterhalb  der Elektronenquelle bündeln  Kondensorspulen die Elektronen mittels eines Magnetfeldes, so dass diese konzentriert auf das Objekt treffen. Dies erfolgt vollautomatisch. Um jedoch die Intensität steuern zu können, befindet sich kurz hinter den Kondensorspulen eine Blende. Mit ihr kann die Intensität der durchtretenden Elektronen geregelt werden.

Nachdem die Elektronen das Objekt durchdrungen haben, können sie nochmals mittels einer Blende in ihrer Anzahl reduziert werden, bevor sie durch die Objektspulen abermals gebündelt werden. Dies ist nötig, da durch das Objekt einige Elektronen von ihrer Bahn abgelenkt werden.

Anschließend passieren die Elektronen die Projektionsspulen. Hier werden sie gezielt geweitet, damit auf dem anschließenden Leuchtschirm eine scharfe Projektion des untersuchten Objektes dargestellt wird. Soll nun ein Foto des Objektes gemacht werden, wird der Leuchtschirm zur Seite geklappt und die Elektronen treffen auf eine Fotoplatte bzw. einen Fotosensor.

Mit einem TEM sind Vergrößerungen von ca. 100 bis ca. 800.000 fach darstellbar (je nach Modell). Dies entspricht der Vergrößerung auf dem Leuchtschirm beziehungsweise Bildschirm. Mit Hilfe eines Binokulars lässt sich zusätzlich die primäre Vergrößerung noch einmal 10fach vergrößern. Um Viren unter dem TEM sichtbar zu machen, wird die Negativkontrastierung angewendet.

Auswertung

Das unten stehende Gelbild wurde an einem Praktikumstag im Schülerlabor aufgenommen. Daneben ist der Längenstandard (Marker) abgebildet, rechts außen ist das Bandenmuster dargestellt, das bei der Spaltung des Lambda-Phagen mit EcoRI und HindIII zu erwarten ist.

Zuerst werden die beiden Kontrollen ausgewertet. Bei der Negativkontrolle ist keine Bande vorhanden, sie zeigt also das gewünschte Ergebnis. Die ungespaltene DNA ist die Positivkontrolle. Sie zeigt eine stark fluoreszierende Bande im oberen Bereich des Gels und somit ebenso die erwartete Bande für das sehr große DNA-Fragment.

Nun werden die Banden der Restriktionsspaltung betrachtet. Sie weisen das Bandenmuster auf, das bei der Spaltung eines Lambda-Phagen mit EcoRI und HindIII zu erwarten ist. Bei den untersuchten Proben handelte es sich also um den Lambda-Phagen.

Als nächstes wird der PCR-Versuchsteil ausgewertet. Stamm X zeigt eine Bande von ca. 500 bp Größe, Stamm Y zeigt keine Bande. Somit war in Bakterienstamm X ein spezifisches Fragment des Lambda-Phagen im lytischen Zyklus inseriert, in Stamm Y nicht.

Der Längenstandard (Marker) wird bei der Analyse zur Bestimmung der Größe der DNA-Fragmente verwendet.

Die obenstehende Abbildung zeigt das Ergebnis der Untersuchung mit dem Elektronenmikroskop. Es wird mit dem spezifischen Aufbau des Lambda-Phagen verglichen. Gut zu sehen ist der charakteristische Kopf mit einem Durchmesser von ca. 80 nm und der zugehörige Schwanz mit einer Länge von ca. 160 nm. Daraus folgt, dass es sich bei dem untersuchten Virus um den Lambda-Phagen handelt.